【摘要】  目的 建立白土茯苓中β-谷甾醇的含量测定方法。方法 采用高效液相色谱法,色谱柱为sinachrom ODS-BP(4.6 mm×250 mm,5 μm),甲醇-0.1%磷酸(98∶2)为流动相,检测波长为210 nm,流速为1.0 mL/min。结果 β-谷甾醇在0.22～8.8 μg范围内线性关系良好,r＝1.000 0；平均回收率为96.5%,RSD＝1.15%。结论 本方法简便准确,重复性好,可作为白土茯苓药材质量控制的有效方法。

【关键词】  β-谷甾醇；白土茯苓；高效液相色谱法；含量测定

　　Abstract：Objective To establish the method to determine the content of β-sitosterol in Rhizoma Heterosmilacis Japonicae. Method β-sitosterol in Rhizoma Heterosmilacis Japonicae was determined by HPLC. Chromatographic column was sinachrom ODS-BP 5 μm column (4.6 mm×250 mm). Mobile phase was methanol-0.1% H3PO4 liquor. Detection wavelength was 210 nm. Flow rate was 1.0 mL/min. Result β-sitosterol showed a good linear curve in the range of 0.22～8.8 μg (r＝1.000 0). The average recovery was 96.5% with RSD of 1.15%. Conclusion The method was accurate and reproducible, and can be used to control the quality of Rhizoma Heterosmilacis Japonicae.

　　Key words：β-sitosterol；Rhizoma Heterosmilacis Japonicae；HPLC；content determination

　　白土茯苓为百合科肖菝葜属植物肖菝葜、短柱肖菝葜、华肖菝葜的干燥块茎。春、秋二季采挖,除去须根及泥沙,洗净,趁鲜切片,晒干。其主要分布于湖南、四川、云南和贵州等地。白土茯苓味甘、淡,性平,主治小便淋涩、白浊、带下、痈肿疮毒。临床多用于治疗筋骨挛痛、瘰疬痈肿、梅毒、钩端螺旋体病。

　　国内外有关白土茯苓的研究较少。20世纪70年代,曾从白土茯苓中分离得到β-谷甾醇(β-sitosterol)、棕榈酸(palmaiticacid)和硬脂酸(stearic acid)等[1-4]。药理实验表明,β-谷甾醇具有明显的降胆固醇、止咳、抗癌、抗炎等药理作用[5]。目前报道的分析方法有薄层扫描法、气相色谱法、高效液相色谱-紫外检测法、高效液相色谱-ELSD法等[6-8]。本试验对白土茯苓中β-谷甾醇含量进行测定。在选定的色谱条件下,供试溶液中β-谷甾醇与相邻组分分离度良好。经方法学考察,方法的重复性、稳定性、精密度、加样回收率均符合有关规定,可用于该药材的质量控制。

　　1  仪器与试药

　　Aglient 1100高效液相色谱仪：AglientG四元泵(Quatpump), Aglient G1322A真空在线脱气机(Degrasser),Aglient G1313A自动进样器(ALS),Aglient G1315 DAD二极管阵列检测器, Aglient chimstation system(安捷伦化学工作站)；电子天平(德国赛多利斯,BP-211D型)；超声波清洗器(KQ3200DB型,昆山市超声仪器有限公司)。

　　三氯甲烷(天津市申泰化学试剂有限公司)；无水乙醇(北京化工厂)；甲醇(色谱纯,天津科密欧公司)；磷酸(北京红星化工厂)。β-谷甾醇对照品(中国药品生物制品检定所,批号11085-200504)；白土茯苓(山西振东药业提供,来源为贵州省安顺市多个县区,经本院李先荣教授鉴定为百合科肖菝葜属植物短柱肖菝葜)。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件

　　色谱柱：sinachrom ODS-BP(5 μm,4.6 mm×250 mm)；检测波长210 nm；流动相：甲醇-0.1%磷酸(98∶2)；流速：1.0 mL/min。理论塔板数均大于3 000。色谱图见图1。注：A.β-谷甾醇对照品；B.白土茯苓供试品 图1白土茯苓HPLC图谱

　　2.2  对照品溶液的制备

　　精密称取β-谷甾醇对照品4.4 mg,置10 mL容量瓶中,加无水乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得对照品溶液。

　　2.3  供试品溶液的制备

　　取白土茯苓粉末约5 g,精密称定,置于锥形瓶中,加三氯甲烷100 mL,浸泡1 h,超声处理(功率150 W,频率40 Hz)1 h,滤过,蒸干,残渣加无水乙醇使溶解并转移置25 mL量瓶中,加无水乙醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,即得供试品溶液。

　　2.4  线性关系考察

　　分别精密吸取0.5、1、2、5、10、20 μL的对照品溶液,注入液相色谱仪中,按上述色谱条件测定色谱峰面积。以峰面积为纵坐标,对照品质量为横坐标,绘制标准曲线,回归方程为：Y＝29.621X＋2.180 7,r＝1.000 0。结果显示,进样量在0.22～8.8 μg范围内线性关系良好。

　　2.5  精密度试验

　　取对照品溶液10 μL,在上述色谱条件下重复进样5次,分别测得β-谷甾醇峰面积,结果β-谷甾醇峰面积RSD＝1.03%,表明仪器精密度良好。

　　2.6  稳定性试验

　　取同一份样品供试液,分别于配置后0、2、5、9、12 h进样测定,测得β-谷甾醇含量的RSD＝1.80%,表明供试品溶液在12 h内稳定。2.7  重复性试验

　　取同一批样品粉末约5 g,共5份,精密称定,分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液,各取20 μL分别进样测定,结果β-谷甾醇含量平均值为0.073%,RSD＝0.91%。

　　2.8  加样回收率试验

　　取样品5份,每份取粉末约2.5 g,精密称定,准确加入β-谷甾醇对照品一定量,按“2.3”项下方法制备,测定含量,计算回收率,结果见表1。表1加样回收率试验结果

　　2.9  样品含量测定

　　取3批白土茯苓药材样品,按“2.3”项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取10 μL,按上述色谱条件测定,结果见表2。表2样品含量测定结果

　　3  讨论

　　本试验采用HPLC法测定白土茯苓中β-谷甾醇的含量,操作在常温下进行,方法灵敏度高,操作简便、快速,为白土茯苓中β-谷甾醇的含量测定提供了可靠的依据。

　　在选择提取溶剂时,对氯仿、甲醇、乙醇进行了比较,结果表明,氯仿不仅提取效率高,而且杂质少。

　　在选择提取方法时,对索氏提取法[9]和超声提取法进行了比较,结果表明,超声提取法时间短、效率高、成本低,优于索氏提取法。

　　流动相采用甲醇-水(98∶2)时,峰的对称性不好,经改用甲醇-0.1%磷酸流动相系统后峰形状得到了改善,而且分离效果得到了提高。

【参考文献】
  1 M Luz Cardona. Synthesis of natural polydroxystilbeness[J]. Tetrahedron,1986,42(10)：2725－2730.

　　2 乔 蕾,袁久志,程海燕,等.白土茯苓的化学成分研究[J].中药材,2007, 30(10)：1242－1244.

　　3 阮金兰,邹 健,蔡亚玲,等.菝葜化学成分研究[J].中药材,2005,28(1)：24－26.

　　4 秦文杰,王钢力,林瑞超.短柱肖菝葜化学成分的研究[J].中药材,2007, 30(8)：959－960.

　　5 王 莉,杨永杰,陈松华,等.β-谷甾醇对子宫颈癌细胞微管系统的影响[J].中华医学杂志,2006,86(39)：2771－2775.

　　6 李英霞,谷颜杰,马承严.HPLC同时测定大豆甾醇提取物中β-谷甾醇和豆甾醇的含量[J].中成药,2008,30(5)：751－752.

　　7 王淑美,吴明侠,许 闽,等.地黄中β-谷甾醇的含量测定[J].黑龙江医药,2001,14(4)：255－256.

　　8 张海波,李 钦.HPLC-ELSD法测定不同时期玉米须中β-谷甾醇的含量[J].河南大学学报,2006,25(4)：53－55.

　　9 毛杏飞,张丽君,吴 琼.白花蛇舌草中β-谷甾醇提取工艺的研究[J].药学服务与研究,2002,2(4)：244－245.